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使用酶標(biāo)儀檢測(cè)鈣離子的方法

作者：admin    時(shí)間：2021-06-25 00:56:15    點(diǎn)擊次數(shù):1576
　         酶標(biāo)儀主要通過(guò)兩種方式檢測(cè)鈣離子通路:
     1,熒光方法。
       化合物與細(xì)胞膜上的離子通道結(jié)合后，離子通道的狀態(tài)發(fā)生改變，通道被打開(kāi)，鈣離子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，與細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光指示劑結(jié)合，發(fā)出熒光并被酶標(biāo)儀捕獲。熒光強(qiáng)度與進(jìn)入細(xì)胞的鈣離子含量成正比。熒光指示劑大多是FLuo3。Fluo3-AM是乙酰甲酯的衍生物，可以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)酯酶切成氟，留在細(xì)胞內(nèi)。鈣離子進(jìn)入細(xì)胞后與它結(jié)合，它發(fā)出強(qiáng)烈的熒光。
     2、發(fā)光的方法。
        A水母發(fā)光蛋白復(fù)合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔腸素組成。只有鈣離子(Ca2+)與復(fù)合物結(jié)合時(shí)，coelenterazine才能被氧化產(chǎn)生高能產(chǎn)物Coelenteramide，同時(shí)釋放CO2和藍(lán)色熒光(-466 nm)。正是這種Ca2+依賴(lài)的反應(yīng)過(guò)程(見(jiàn)圖1)使得coelenterazine非常適合監(jiān)測(cè)活細(xì)胞中的鈣離子水平。
      與傳統(tǒng)的熒光鈣離子指示劑相比，它具有以下優(yōu)點(diǎn):
      1)、可檢測(cè)范圍廣泛的鈣離子濃度-從0.1 μM到>100 μM;
      2)、樣品無(wú)自身熒光，且背景熒光低于使用的鈣離子熒光指示劑;雖然信號(hào)比熒光鈣離子指示劑弱，但通過(guò)成像儀器可以獲得較高的信噪比，因此具有較高的靈敏度。
      3）、丙泊林復(fù)合物可以穩(wěn)定地維持在細(xì)胞內(nèi)，使其能夠監(jiān)測(cè)鈣離子數(shù)小時(shí)至數(shù)天。

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